蛋白提取有什么方法?

蛋白提取是许多实验室都会涉及到的实验，操作起来也是非常的简单。

对细胞内及组织中蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同***生物体不同的组织，其细胞破坏难易不***，使用方法也不完全相同。主要的方法有：

（***）机械匀浆

（二）反复冻融

（三）超声波

（四）表面活性剂处理

（五）低渗或高渗溶液

通常是将组织或细胞按照1：10（重量与体积比，w/v）的比例放入冰冷的蛋白提取液，破碎细胞后，将蛋白释放入溶液，通过离心与其他杂质成分分离。

常用的蛋白质提取液包含以下成分：

（***）缓冲体系

缓冲体系主要用于稳定溶液的pH值，阻止少量酸碱对溶液pH值的影响，保持其与细胞内蛋白质生理状态的pH值（7.0-7.5）基本***致，对维持溶液中蛋白质的稳定十分必要。常用的生物缓冲体系有Tris-base，Hepes和MOPS等等。  

（二）盐金属离子和金属螯合剂

许多蛋白质在稀盐溶液中才能溶解，因此提取液中需要包含***定的盐离子。***般采用0.15mol/L左右的NaCl或KCl来模拟生理状态下的离子强度。但是二价金属离子如Ca2+、Mg2+多是金属酶的组成部分，参与其活性调节，去除二价金属离子能抑制这些酶的活性，对提取的蛋白质起保护作用。通常在蛋白质提取液中加入金属离子螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)，可以去除这些金属离子。  

（三）还原剂

细胞***旦破碎，由于和氧接触以及生物抗氧化剂被稀释，导致很多蛋白质尤其是含巯基蛋白被氧化而失活。加入还原剂，如二硫苏糖醇（DTT）、巯基乙醇（ME）、抗坏血酸（Vitamin C）等可以有效阻止巯基蛋白的氧化，保持其活性。  

（四）表面活性剂

表面活性剂，又称去垢剂，为双极性分子，同时具有疏水性与亲水性基团。通过与“膜结合蛋白”疏水区的结合，增强其水溶性，使其能在水溶性提取液中稳定存在。常用的表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、SDS及脱氧胆酸钠等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子型（Triton X-100 、Tirton X-114、NP-40和Tween-20）等。非离子型表面活性剂比离子型温和，不易引起酶失活，应用较多。对于膜结构上的蛋白，常采用胆酸盐处理，两者形成复合物，并带上净电荷，由于电荷的排斥作用能使膜破裂，起到破膜作用。此外，还有两性表面活性剂，如CHAPS，加入后可避免蛋白质冻存导致的沉淀变性，多用于等点聚焦电泳。  

（五）酶抑制剂

细胞中普遍存在蛋白水解酶和磷酸酶，细胞破碎后能从膜性结构（溶酶体）中释放出来。因而，蛋白提取时要注意防止蛋白酶引起的水解和磷酸酶（去磷酸化）等对蛋白质样品的化学修饰。低温是抑制酶活性、防止蛋白水解和修饰有效方式之***。加酶抑制剂也同样起到保护作用。