显微镜的产生和发展对于生命科学研究的进步有至关重要的作用，它将微观世界呈现在大***面前，包括微生物的存在、组织细胞结构及生理病理活动等。显微镜技术的不断革新将成像分辨率不断提高，但相当长***段时间内光学成像无法突破***个极限值，即xy轴横向分辨率约200nm，z轴纵向分辨率约500nm，因此小于这个尺寸的生命活动和结构，如病毒、亚细胞结构等无法清楚地观察到。

聚焦点的光强会根据点扩散函数（point spread function，PSF）而展开，对于圆形孔径，PSF呈现为艾里斑（Airy disk）的模式。激光扫描共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）的分辨率取决于PSF的大小，如果焦点很小，则每个像素点获取到的信息也很小，从而得到清晰锐利的图像；反之，则结果图像变得模糊。因此，CLSM成像的主要挑战在于实现越来越小的PSF以获得更好的分辨率。德***物理学***恩斯特·阿贝（Ernst Abbe，1840-1905年）在19世纪70年代***次提出阿贝衍射极限，即由于衍射效应，PSF大小与λ/NA成正比（d=0.61λ/NA），其中λ是光的波长，NA是物镜***重要的参数——数值孔径。由于可见光波长范围在400-760nm之间，NA值***大在1.7左右，所以分辨率极限在200nm左右。随着物理学和测量技术的进步，突破衍射极限的显微镜不断涌现，公认的超高分辨显微镜主要有三类，包括结构照明显微镜（Structured Illumination Microscopy，SIM），受激发射损耗显微镜（Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED），和单分子定位显微镜（SMLM）。单分子定位显微镜包括光敏定位显微镜（Photoactivation Localization Microscopy，PALM）和随机光学重构显微镜（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）。2014年三位科学***史蒂芬·霍尔（Stefan W. Hell）、埃里克·贝兹（Eric Betzig）和威廉·莫纳（William E. Moerner）因他们在超高分辨显微镜技术领域的贡献而获得了诺贝尔化学奖。当然，新兴***低光子数显微成像（MINimal Photon FLUXes，MINFLUX）作为第四类超高分辨显微镜，也被更多的学者了解和关注。

超高分辨显微镜成像既利用了光学显微成像原有的无损性质（与电镜高分辨成像相比），又可以很好地突破普通显微镜中衍射极限对成像分辨率的限制，因此其发明和发展对于生命科学和生物医学研究具有非常重要的意义。不同类型的超高分辨显微镜自问世后均被广泛应用于生命科学领域中，包括生命体细胞结构和功能的探索以及疾病的发生发展机制等。不过，不同类型的超高分辨显微镜由于空间分辨率、时间分辨率、光漂白和光损伤等诸多问题，实际应用中各有利弊。虽然成像技术发展很快，但技术限制依旧存在，如何获得更高的空间分辨率、更深的成像深度和更快的时间分辨率以满足更精确更快生物过程的研究依旧任重道远。

SIM技术的前身可以追溯到20世纪70年代初。当时，光学学***特奥多尔·赫普恩（Theodor H?upl）***次提出了使用周期性光栅照明来提高显微镜分辨率的想法。这奠定了SIM技术的基础，尽管当时还没有实体的SIM显微镜。21世纪初期，SIM技术开始广泛传播，吸引了生物学***和显微镜专***的关注，它是***种相对低成本的超高分辨率成像方法，因为它不需要昂贵的激光设备或复杂的样品准备。

SIM本质是激发光透过可横向移动的光栅产生正弦条纹图案照射样品，正弦条纹照明图案与样品本身的信息叠加形成莫尔条纹，将样品结构中的高空间频率信息转变为可通过物镜收集的较低空间频率信息，***后通过后期数据处理得到样品的高分辨图像。SIM的单幅原始图像的采集速度只取决于样品的荧光信号强度和探测器的采集速度，通常只需要采集9帧原始图像，与基于点扫描成像的STED和需要采集几万帧原始图像的SMLM相比，要快得多，基本可以达到实时观察。但SIM受其成像原理的制约，***多只能将横向分辨率提升为传统显微镜的2倍（即100 nm左右），因此分辨率远不及其他超高分辨显微镜技术。但SIM对荧光探针没有光开关或抗淬灭的特殊需求，其***大的优势也是宽场成像速度快，所以更多更广泛地应用在活细胞成像领域。

单分子定位显微镜中荧光标记的单个分子被分别激发和检测，可以极高的精度确定单分子的中心从而实现高分辨率，包括光敏定位显微镜（Photoactivation Localization Microscopy，PALM）和随机光学重构显微镜（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）。

PALM的历史可以追溯到2006年，由埃里克·贝兹（Eric Betzig）和哈拉尔德·赫斯（Harald Hess）提出了单分子定位这***概念。同期STORM的成像技术也发展起来，代表是华人科学***庄小威。STORM和PALM工作原理类似，都是通过特殊的分子标记和随机活性化，实现单分子定位进而实现超高分辨率成像。在SMLM成像中，光开关荧光蛋白（PALM）或闪烁染料（STORM）扮演着重要角色，它们在“开态”和“关态”间可以相互转换，处于开态时可被激发产生荧光，而处于关态时不发射荧光。在每***个成像周期内随机只让***小部分荧光团打开，其余荧光团暂时关闭，这样每***幅图像中荧光团的光斑不会重叠，可以高精度地定位出每个荧光团的位置。重复这个过程，使每个周期内都随机打开***部分荧光团，这样可以在不同时间点捕获标记物的位置，通过记录标记物的位置可以得到它们的坐标，获得足够多的数据点可将所有的定位信息叠加起来，就能重构出***幅超分辨图像。这种以成像时间换取空间分辨率的形式，使得PALM或STORM的分辨率通常能够达到数十纳米。

德***科学***Stefan W. Hell于1994年***次理论上提出STED显微镜的概念，并在2000年进行实验验证。STED超高分辨技术的基础原理是利用受激发射效应减小有效荧光发光面积，即在STED显微成像中，通过使用***个激发光束和***个环形的耗损光束，使得荧光分子的激发区域比阿贝衍射极限更小。耗损光束通过受激发射将外围的荧光分子去激发，只留下中心区域的荧光信号，从而实现纳米***别的分辨率。我们也叫它“甜甜圈”技术。STED成像技术可以通过非线性效应提高分辨率，即其分辨率与STED“甜甜圈”损耗光强有关，提高“甜甜圈”光的强度可以使荧光光斑焦点中心直径缩小，但是实际应用中，光损伤较大，“甜甜圈”光强不可能无限增加，顾其分辨率***高可达到30nm左右。此外，STED成像技术还包括对光束进行精确调制、校准和扫描，以及采用高性能探测器进行成像，加之其“甜甜圈”光毒性、光淬灭等问题比较明显，STED技术对荧光染料和封片剂的抗淬灭要求较高。

近年来，得益于新的硬件革新及技术手段的引入、荧光染料和探针的改进、光学系统的优化和更精确的成像算法等，STED技术在分辨率和应用方面都有了显著提升，发展为易用、稳定的成熟商业产品，逐步成为生物医学领域中重要的研究工具。STED技术结合荧光寿命成像更是发挥了降低损耗光强度优势、打破相近波长染料不可共染的限制，进***步降低了光漂白、提高了分辨率。