徕卡175周年：膜片钳技术简介

那时，电压钳仅能用于相当大的细胞，因为需要锋利的微电极来穿透质膜。在1970年代末，贝尔特·萨克曼（Bert Sakmann）和埃尔文·内尔（Erwin Neher）改进了电压钳技术，并且***次解析了青蛙骨骼肌膜片上的单离子通道电流。他们因此荣膺1991年诺贝尔生理学和医学奖[4,5]。下***个突破则是贝尔特·萨克曼（Bert Sakmann）在1980年发明的高阻封接，极大地提高了信噪比，并允许记录更小的电流[6]。

电生理学，***初诞生在特殊的生物物理实验室，现在已经扩展到基础生物学和医学研究领域，并成为研究神经系统中单个细胞或整个细胞网络行为的***重要工具之***。

膜片钳技术可以研究若干，甚至单个离子通道[7]。因此，它引起了兴奋类细胞研究工作的极大兴趣，例如神经元、心肌细胞和肌纤维。[8]

单个离子通道每秒可以传导约1000万个离子。不过，电流仅有几皮安。记录这种数量***的电流不仅对研究人员，对于设备而言同样极具挑战。原理是将带有钝端的薄玻璃或石英管密封在膜上（参见图1、2和3）。

施加吸力可以产生千兆欧姆***别的高阻抗封接。这种紧密封接可以对膜片进行电隔离，这意味着流过膜片的所有离子都会流入微电极，并借助连接到高灵敏度电子放大器的氯化银线电极（(Ag/AgCl)电极）记录。浴电极用于设置零电平。

为了防止细胞膜电位发生变化，放大器会产生类似于流经细胞膜电流的补偿电流，作为负反馈机制（参见图1）。

测量细胞的膜电位并将其与指令电位进行比较。如果指令电位和测量值之间存在差异，则会注入电流。该补偿电流将记录下来，并可以得出有关膜电导的结论。膜电位可以独立于离子电流进行操纵，这种能力可以研究膜通道的电流-电压关系。

通过电极微管施加造孔剂（通常为抗生素）会产生穿孔膜片来保证离子连续性，同时细胞内蛋白质不会被电极液洗掉。***常用的膜片钳模式是全细胞模式（参见图3）。要实现这种模式，通过短暂施加强吸力来破坏膜片。微电极内部与细胞质连为***体。该方法用于记录来自整个细胞的电位和电流。对于全细胞测量方式，研究人员有两种配置方式可供选择：电压钳模式，其中电压保持恒定并记录电流，或者电流钳模式，其中电流保持恒定并观察膜电位的变化。

此外，也可以仅记录来自小块而不是整个细胞的电流。这增加记录单个离子通道的机会。膜片可以根据微电极内部的两个不同方向确定方位。为实现内面向外的配置，微电极贴附在细胞膜上，并且可以收回以撕下***小片膜（图3）。本例中，细胞膜的胞质表面暴露在外面。这种方法通常用于研究单个通道的活性，优点在于可以调整暴露在细胞内表面的培养基。

如果希望研究细胞外诱因（如神经递质）的影响，则应选择外面向外的配置（参见图3）。这种情况下，移液器在全细胞测量配置中收回，导致细胞膜破裂并重组。在该配置中，细胞外表面暴露，因此可以轻松应用细胞外诱因。

根据样品不同，需要使用倒置（培养细胞）或者具有稳定平台的正置固定载物台显微镜（切片样品）。如果要研究急性切片中的细胞，建议使用红外DIC（微分干涉对比）显微镜[9]，后者可以更加方便地观察细胞膜。显微镜应放置在防振台上，因为任何移动都可能对微电极和细胞膜之间的封接造成致命影响。

需要使用显微操作臂来精确移动微电极。加热并拉长小型玻璃或石英毛细管可以形成极细的微电极管。电极管吸头的直径约为1微米，其中包含的膜片仅含几个（甚至***个）离子通道。微电极管吸头需要在熔融状态进行热抛光，以便在吸头接触到细胞膜后实现高阻抗封接。电极管中含有类似于胞外溶液或细胞质的溶液，具体取决于记录模式。微电极安装在显微操作臂上，可以向细胞膜***移动。

为了检测电流，使用了氯化银线。同样采用氯化银线（作为银/氯化银电极）的浴电极设置为零电流值。带低噪声晶体管的差分放大器连接到计算机，以进行数据采集和数字化，可以采购特定软件来控制该放大器并分析数据。或者，可以使用示波器来监测电流。如有需要，可以为该配置添加灌注系统。特定物质可以通过灌注笔或使用POC（灌注开关）室添加。