徕卡175周年：入射光荧光显微镜的里程碑
- 2024-08-16 09:23:51
自上世纪中叶以来，荧光显微镜发展成为***种生物科学工具，对我们了解生命产生了***大的影响。在荧光分子的帮助下观察细胞和蛋白质是当今几乎所有生命科学学科的标准方法。这种广泛的应用可以追溯到***些研究人员的技术工作，他们希望改进和简化荧光显微镜下的劳动。荷兰医生约翰-塞巴斯蒂安-普洛姆（Johann Sebastiaan Ploem）就是其中的***位参与者。
约翰-塞巴斯蒂安-普洛姆（Johann Sebastiaan Ploem）于 1927 年出生在苏门答腊岛的泽兰托（Sawahlunto），是***名荷兰煤矿工程师的儿子。幼年时，他随父母回到荷兰，并在那里将绘画作为自己的爱好之***。高中毕业后，他发现了另***个令人着迷的色彩领域，我们稍后会了解到。Ploem 决定学习医学，并在乌得勒支、哈佛和阿姆斯特丹接受教育。随后，他开始了学术生涯，曾在迈阿密大学和阿姆斯特丹大学工作，后晋升为荷兰莱顿大学医学系教授。
在研究活动中，他发现荧光显微镜是***种强大的工具。20 世纪 60 年代，***种特殊的标本照明方式开始流行，事实上，早在 1925 年，对丝虫自发荧光事件感兴趣的 Policard 和 Paillot 就已经知道并描述了这种照明方式（Policard 和 Paillot，1925 年）。***些研究人员重新启动了这两位法***科学***的项目，将荧光照明和样品检测放在显微镜的同***侧。这种利用入射光的原理被称为 "Epi-Illumination"，与透射显微镜形成鲜明对比。在荧光显微镜中使用这种技术的***大好处是可以避免检测光源发出的发射光（图 1）。另***个优点是机械性更强：在透射照明中，聚光器和物镜有两个独立的光轴，必须仔细对准。而在外延照明中，物镜既是聚光器，又是集光物镜。这样就可以避免对准问题。
图 1：外延照明在荧光显微镜中的优势：在透射照明的情况下（左图），光源和图像检测位于物镜的两侧。在这种设置下，***个明显的限制就是无法检测到激发光（浅蓝色）。相比之下，Epi-Illumination（右图）使用物镜进行照明和图像检测。对于荧光显微镜来说，这意味着用户不会受到激发光的照射。
早在几年前，前苏联的两位研究人员就为荧光外延照明显微镜提供了非常重要的投入。Brumberg 和 Krylova 开发了***种所谓的二向色分光器，用于入射光的紫外激发（Brumberg 和 Krylova，1952 年）。
二向色材料能够让特定波长范围的光通过，而其他波长的光则被反射（图 2）。
这***原理对于荧光外延照明是不可或缺的，因为激发光必须以某种方式融合到显微镜的光路中（图 3）。更确切地说，二向色分光镜无法穿透光源发出的所需激发光的波长，只能将激发光反射到样品上。样品发出的荧光反过来又可以通过二向色分光器到达检测端。
图 2：透射图说明了二向色分光镜的功能。波长较短的光（蓝色箭头）会被反射，而波长较长的光（红色箭头）则可以通过滤光器。
图 3：荧光外延照明需要***个二向色镜（灰色），它能够将激发光（蓝色）反射到试样上，并将发射光（绿色）传递到检测端。激发光的波长可通过相应的滤光片（橙色）进行预选。朝向检测侧的滤光片（紫色）只允许荧光团的波长通过，并排除激发光的残余杂散光。
遗憾的是，由于铁幕之间缺乏信息交流，Ploem 并不知道俄罗斯的发展情况。尽管如此，他还是自己开始使用二向色分光镜。针对 Ploem 的特殊情况，他与***的特种玻璃生产商肖特公司（美因茨）共同开发了***种可反射蓝光和绿光的分光镜（Ploem，1965 年）。之后，他用 Leitz 公司提供的中性分光镜改装了***台 "Opak" 外延照明器，通过引入***个带有四个不同二向色分光镜的滑块，他可以在紫外线、紫光、蓝光和绿光之间非常快速、方便地改变激发光的波长（Ploem，1967 年）（图 4）。
图 4：荧光多波长外延照明器，带有四个安装在滑块中的二向色分光镜，用于紫外、紫光、蓝光和绿光的入射照明。由阿姆斯特丹大学制造（Ploem，1965 年）。
开发二向色分光镜以产生不同波长的激发光具有重要的优势。当时，紫外光谱（约 100 nm - 380 nm）的激发光非常普遍，但却有***个恼人的副作用：自发荧光。很多组织物质都会被紫外线激发，从而产生微弱的背景光（图 5）。通过将二向色镜的反射波长调整到绿色或蓝色范围，Ploem 能够达到当时非常常用的两种荧光染料 FITC（494 纳米）和 TRITC（541 纳米）的激发***大值，而不会产生自发荧光。FITC（异硫氰酸荧光素）和 TRITC（四甲基罗丹明-5（和 6）-异硫氰酸酯）可与抗体耦合，目前仍用于免疫荧光显微镜。通过在较小范围内达到其激发***大值，组织标本的对比度得到了显著增强（图 5）。使用 Ploem 的二向色分光器产生的激发光束能有效地与 FITC 的激发***大值相匹配，即使是发射光谱很差的光源也能使用。
图 5：左图：用宽波段紫外激发光照射标记有免疫标记（FITC）的组织细胞。注意带有蓝色自发荧光的组织结构。右图 使用窄波段蓝光（490 纳米）外延照明，对相同的组织和相同的 FITC 标记进行免疫染色。注意图像对比度的增加（Ploem，1967 年）。
有鉴于此，现在可以利用外延照明的优势，使用普通的高压汞弧光灯提供蓝光和绿光的窄带激发。这***改进满足了生命科学和医学领域对荧光显微镜的需求。
根据 Ploem 的发明，Leitz 设计出了***种新型多波长荧光外延照明器，它带有四个旋转式二向色分光镜，可在紫外、紫光、蓝光和绿光范围内激发标本，这就是 Leitz PLOEMOPAK。
莱茨员工卡夫（W. Kraft）取得了更大的成就，他将二向色分光器与适当的激发和发射滤光器组合在***个工件上，即所谓的滤光器立方体或滤光器块（卡夫，1969 年和卡夫，1972 年）（图 6）。他的研究成果是设计出了***种外延照明器，该照明器带有多组四个这样的滤光器立方体，如今几乎所有的多波长荧光显微镜都是以这些滤光器立方体为基础的。
图 6：左：1970 年左右，Leitz 员工 W. Kraft 将激发滤光片（橙色）、二色分光镜（灰色）和发射滤光片（紫色）集成在***个工件上 - 滤光片立方体。中间：滤光器立方体的工程图。右图 在现代显微镜中，荧光滤光片立方体可以很方便地点入和点出。研究人员甚至可以根据自己的需要，用不同的滤光片和二向色分光器改装***个立方体。
总 结
有了 Ploem 及其同代人和后继者建立起来的技术基础，我们***就可以通过将适当的滤光器立方体放入外延照明器（图 7），观察到无数不同的荧光团。研究人员甚至可以根据自己的需要定制激发和发射参数。
由于现代研究显微镜的自动化，在实验过程中切换滤光器立方体只需点击***下按钮。科学***们可以在***瞬间切换不同的荧光团，从而观察到即使是活体标本也被荧光标记为不同的荧光团。
图 7：荧光显微镜的演变。左图：透射光荧光显微镜的基本问题是检测激发光。中图 这就是人们利用外延照明并将光源移到显微镜检测侧的原因。这种方法需要二向色分光镜。右图 将激发滤光片、发射滤光片和二向色分光器放在***个区块中，可以快速切换不同的区块，专用于某些荧光团。
(文章来源于仪器网)
