胶原蛋白重组大公开，让CHO cell承“胞”你的美！

2024-07-10 09:21:06

古今中外，爱美之心人皆有之，人们通过食补、医美等方式来维持肌肤吹弹可破，光泽饱满的状态。在医美中，注射类产品包括胶原蛋白类、玻尿酸类、以聚乳酸代表的再生制剂类、肉毒素类，以及新兴起的外泌体类等类别。其中，胶原蛋白作为人体各种组织内的细胞外基质 (ECM) 主要成分，以其优良的生物相容性备受消费者青睐。

胶原蛋白由三条多肽α链组成的独特三螺旋结构，每条α链约有1014个氨基酸，分子量约为300 KDa。***般α链是重复的氨基酸序列甘氨酸-X-Y结构，X和Y多数为脯氨酸 (Pro) 和羟脯氨酸 (Hyp) [1]。目前已发现人体中含有28种不同的胶原蛋白，各具有不同的高***结构。胶原蛋白类型按照发现的时间顺序以罗马数字命名 (I–XXVIII) 命名，而在我们的皮肤中，I型、III型、Ⅴ型、Ⅵ型胶原蛋白占据较大比例。

图1：天然胶原蛋白结构

什么是更佳的胶原蛋白提取方式？

传统胶原蛋白从动物结缔组织中提取获得，提取方法主要包括高压辅助的物理方法、溶剂抽提的化学方法、酶的生物化学法。但以上方法提取出来的胶原蛋白存在动物源疾病等风险。而重组胶原蛋白具有更好的生物相容性和更低的免疫原性。此外，重组胶原蛋白变形温度在72℃以上，远高于动物源胶原蛋白的40℃，更易运输和储存，在医美行业中使用更为广泛。重组表达系统包括如大肠杆菌、酵母、动物细胞、转基因动物和转基因植物等。但以大肠杆菌和酵母为体系生产出来的胶原蛋白容易出现氨基酸序列简单重复，无羟基化修饰等问题，在常温条件下其三螺旋结构松散，甚至呈现出单链线性结构。

CHO细胞作为***具代表性的动物细胞表达系统，具有准确的重组蛋白翻译后修饰，表达出的蛋白在理化特性和生物学功能***接近天然蛋白。在生产重组蛋白药物生产中有着悠久的历史。CHO细胞表达的重组胶原蛋白能完美还原天然胶原蛋白的三螺旋结构，即使在常温条件下其三螺旋结构仍能紧密维持。

案例分享

1997年，Fukuda等人[2]***次发表CHO细胞表达IV型胶原蛋白 [α1(IV)] 2α2 (IV) 。研究人员使用CHO DHFR缺陷型细胞作为宿主细胞，***先将质粒转染至细胞后进行加压 (MTX) 筛选，终克隆A222可高表达α1 (IV) ，随即将表达α2 (IV) 的逆转录病毒载体感染克隆A222细胞以获得CHO A222-A2细胞，即可同时表达 [α1(IV)] 和α2 (IV) 。

图2：α1 (IV) 2和α2 (IV) 的合成和分泌。Lane A-C：培养上清，Lane D-I：细胞裂解物。G和H：还原条件，A-F，I：非还原条件。Lane A，D：MT-7 CHO细胞，lane B，E和G：CHO A222细胞，lane C，F和G：CHO A222-A2细胞，lane I：细菌胶原酶消化CHO A222-A2细胞的细胞裂解物。

从SDS-PAGE结果可以看出，CHO A222细胞可表达185 KDa大小的单链α1 (IV) （图2.F）。同样，在CHO A222细胞的培养基上清中可检测到有185 KDa的大小的α1 (IV) （图2.G）。Control CHO MT7细胞未合成α1 (IV) 或α2 (IV)（图2.A&D）。另外，表达的α1 (IV) 应该是单链结构，因为在图2.B&E中未见更大分子量的蛋白存在。这些结果表明CHO A222细胞产生的单链α1 (IV) 会外泌出细胞。CHO MT7细胞在感染后会表达出170 KDa的单链α2 (IV) ，但不会形成三聚体 (data not shown) 。CHO A222-A2细胞可同时表达α1 (IV) 和α2 (IV)（图2.C、F、H），此外，在lane C和F的非还原条件中出现***条大于300 KDa的条带，但在还原条件下（图2.H）此条带消失且170 KDa条带增强。此条带只在CHO A222-A2细胞中产生，且在经过胶原蛋白酶处理后与α1 (IV) 和α2 (IV) 条带均消失，因此可以确定CHO A222-A2细胞表达出IV型胶原蛋白，且后续实验也有进***步验证 (data not shown) 。

胶原蛋白的羟基化修饰对维持胶原蛋白的稳定性有重要作用，在斯坦福大学Marinkovich教授等人著作专利中[3]，研究人员将编码脯氨酰4-羟化酶 (prolyl 4-hydroxylases, P4Hs) 的质粒经电转转进CHO细胞中，并挑选出稳转CHO细胞株。