Echo声波移液合成生物学的DBTL角色

图1 通过 Echo进行PCR体系构建。

Gibson DNA连接方法是合成生物学中使用***多的技术，它可以组装从DNA序列至小基因组重叠DNA片段大小，优点是它与序列无关并生成无痕DNA连接产物。Golden Gate DNA连接方法利用TypeIIS限制性内切酶和连接酶组合来组装DNA片段。正如我们先前所介绍的***样，使用Echo声波移液，能够实现这两种***步式DNA连接反应的降本增效，可在250 nL、500nL和1000 nL反应体积下实现Gibson的正确组装，效率可与手工实验相媲美或优于20 μL反应，这使试剂成本降低20倍以上；Golden Gate可实现50 nL 、250 nL和500 nL规模反应体积的DNA（手工实验时通常为 15 μL反应）成功组装，效率同样高于手工实验对照，使试剂用量至少降低30倍。

生物合成途径的阐明和重构以及调控回路和网络的工程设计，都需要蛋白质功能的知识。植物***直被用作生物活性和高价值天然产物的来源，但由于植物之中大型基因***族的普遍存在，使得将特定功能与单个蛋白质联系起来具有挑战性，同时也面临需要付出大量努力来优化表达和纯化方案进行蛋白质表征这***技术瓶颈。Biofoundry的独特优势能够加速“设计-构建-测试-学习”周期的能力，可加速优化并实现酶活性的快速筛选；无细胞蛋白质合成（CFPS）结合了DNA模板、能量源、氨基酸、核苷酸三磷酸 （NTP） 和过量辅因子，以及含有翻译机制的粗裂解物，是***种成熟的体外快速蛋白质生产工具，显著优势是能够直接进行功能分析，而无需耗时的细胞破碎和纯化方案，同时还适用于自动化和小型化，减少操作错误和CFPS反应中的可变性，促进主动学习引导的反应条件优化，并普遍增加实验的通量，***大限度地减少DBTL循环中的“构建”时间。SynTrack是***个基于web的工作流程驱动的bioCAM平台，用于管理和跟踪DNA制造过程。SynTrack导入boost指定的构建过程信息，其中包括操作人员（利用机器人平台）执行所有“构建”操作的分步说明。SynTrack可以为液体处理机器人（如Biomek FX和Echo平台）生成移液指令，自动将接收到的DNA片段重新排列到孔板中。通过Echo自动化平台构建2μL反应体积（手动为20μL）进行***步法Golden Gate DNA组装反应，随后构建2μL CFPS反应体系进行蛋白表达，通过荧光素酶（该标签可轻松去除）快速定量蛋白表达水平，随后无需蛋白纯化即可使用游离蛋白质合成反应产物进行多种功能表征。

图2 Biofoundry辅助DNA组装和植物蛋白游离蛋白合成（CFPS）的工作流程。编码目的蛋白的0***DNA部分（模块）可以组装成用于CFPS或在植物中表达的功能表达质粒。使用Echo筛选蛋白质变体的文库，使用 HiBiTLgBiT荧光素酶发光实验定量确定***佳表达构型。

使用Echo声波移液配合无细胞蛋白合成（CFPS）技术也可在96和384孔板中进行代谢工程检测，通过Wood-Ljungdahl通路耦合的反向β氧化（r-BOX）通路，实现如C4-C6酸和醇生化产物的负碳合成，具有降低全球CO2排放的巨大应用潜能。正是由于模式生物大肠杆菌无细胞转录-翻译（TXTL）在DNA定向体外蛋白质合成的应用范围越来越大，***些实验室也开发了全大肠杆菌TXTL工具箱，并通过Echo实现了流程自动化。另***个无细胞合成生物应用方向是非模式生物体外原型设计和快速表征代谢途径，加速体内生物合成途径测试，使例如梭状芽胞杆菌等非模式生物能够利用可再生资源（木质纤维素生物质或CO和H₂合成气）生产更多高价值产品。使用DNA组装设计自动化软件J5进行结构设计和生成实验运行worklist，发送至Echo自动化平台以2 μL体积进行Golden Gate DNA组装，可同时进行多达6个部分（三个独特启动子和终止子序列的开放阅读框）的组装，效率高达90%；这***质粒系统将为非模式生物提供体外和体内生物合成途径的简单测试框架，从而缩短开发周期。非模式生物巨双歧杆菌的天然无细胞（NCF）转录翻译平台的快速建立也借助了Echo，并和贝叶斯模型参数推断方法相结合，可以在数小时内对基因表达工具进行严格的表征，并且这个平台还有望扩展到***系列其他重要的底盘微生物的合成生物学应用。

图3 使用兼容的无细胞载体系统组装三基因构建体的Golden Gate。（a）Golden Gate组装工作流程的示意图，包括自动化组装，包括质粒的计算设计、Echo自动化液体处理操作指令、质粒组装和质粒确认。（b）含有构建的梭状芽孢杆菌表达载体的六个克隆中的质粒组装的PCR鉴定。

图4 非模型微生物的无细胞原型设计。（A）在NCF中使用内源性能量再生和转录-翻译组分测试合成的基因表达质粒。（B）在B. megaterium NCF中使用MGapt（mRNA）适配体和GFP进行平行转录-翻译测定。（C）借助Echo液体处理工作站，用于快速筛选无细胞反应的半自动化工作流程。

微生物系统中异源生产的特定高价值化学物质大多需要资源密集型分析过程（如HPLC和MS）进行定量，较低的分析通量使DBTL循环遇到了***定的瓶颈。而生物传感器通常与基因表达系统耦合，为此人们越来越关注开发荧光生物传感器用于合成生物学中，来检测小分子和物理信号。通过为Echo编写Python移液脚本，构建384或1536孔板的10μL或2μL荧光酶标检测体系，基于大肠杆菌双键还原酶（EcCurA）非特异性结合后荧光极大增强的特性，开发了***种荧光复合物直接蛋白质（DiPro）生物传感器，作为微生物异源姜黄素酶促合成的检测单元，且不需要任何额外的基因表达后步骤或特定的蛋白质成熟要求。同样，使用Echo进行小反应体系的荧光素酶化学发光体系构建，高通量筛选分析脯氨酰寡肽酶异源表达变异株，将金属响应开关整合到蛋白质中，也为精确调节蛋白质功能提供了新的机会。

图5 Ni(II)依赖的开关