热点应用丨DNA荧光信标探针检测
- 2024-01-11 09:59:19
分子信标探针是核苷酸序列（DNA 和 RNA 的组成部分），用于荧光检测特定 DNA 或 RNA 序列的存在。分子信标（图 1）的设计使得序列末端的少量核苷酸碱基（5 到 7 个）彼此互补并配对形成所谓的茎。茎的形成产生了***个未配对碱基的环，称为茎环或发夹环。***后，在核苷酸序列的***端有***个共价连接的荧光团，而在序列的另***端有***个荧光猝灭剂。当分子信标处于这种发夹形式时，猝灭剂通过 F?rster 共振能量转移 (FRET) 猝灭极大地减少了荧光团的荧光。
图1：分子信标探针
图2：分子信标和cDNA之间的反应，其中a）是cDNA，b）分子信标，c）杂交双链序列。
实验设置
分子信标探针及cDNA 购自于默克公司。所有数据均从配有 SC-27 （4位温度控制样品模块） Edinburgh Instruments FS5 荧光分光光度计获得。SC-27 用于在单独搅拌的同时加热四种具有不同浓度 cDNA 和分子信标的溶液。配置100 nM 的分子信标以及0 nM、20 nM、40 nM 和 60 nM cDNA 溶液。
图3：FS5荧光光谱仪与SC-27样品架
发夹开口的温度依赖性
cDNA和分子信标之间的杂交可以在信标处于闭合发夹形式时发生，但会缓慢进行。可以通过加热分子信标以打开发夹结构来加速杂交。当加热时，发夹结构的茎碱基对之间的吸引力被克服，这被称为变性，并且发夹打开。可以使用温度依赖性荧光研究此开口的温度依赖性（图 4）。
图4：不同温度下的分子信标荧光强度
DNA检测
将具有不同 cDNA 浓度的分子信标的四种溶液移至比色皿中并放置在 SC-27 的四个位置。为了促进 cDNA 和信标序列的杂交，将溶液通过在 60°C 加热并在该温度下保持 20 分钟进行温育。然后冷却回 20°C 并在该温度下再保持 20 分钟。这种加热和冷却的孵化过程增加了分子信标和 cDNA 之间的杂交率，如图 5 所示。
图5：SC-27中的cDNA和分子信标杂交孵化程序示意图。
图6：在不同浓度的cDNA存在下，分子信标溶液的荧光光谱
图7：cDNA浓度趋势分析
Y = 1.076 × 105 + 6.024 × 102 X
其中 Y 是 516nm 处的荧光强度，X 是 cDNA 浓度，单位为 nM。
根据这种数学相关性，未知样品中 cDNA 的浓度可以通过其荧光强度确定。为了证明这***点，对具有 100 nM 分子信标浓度和未知 cDNA 浓度的样品进行孵育，并测量 516 nm 处的荧光，其cDNA 浓度为 27 nM（图 8）。
图8：cDNA已知浓度样品（橙色点）和未知cDNA浓度样品（红圈）的校准曲线。
结 论
Edinburgh Instruments FS5 荧光分光光度计用于使用分子信标探针以nM量***确定未知浓度的 DNA，与此同时，使用 SC-27 四位温度控制样品模块孵育 DNA 和探针溶液，并自动测量四种溶液的荧光强度，***后使用 FS5 Fluoracle ?软件的定量分析功能分析测试结果。
(文章来源于互联网)
