Irys单分子基因组结构成像系统

让我们组织，而不是堆砌数据

在过去的几年里，二代测序的高通量***直主导着基因组研究的发展。

但是二代测序技术可以廉价的获得大量的测序数据，但是受制于较短的读长，这使得科学***们无法简单而直观地看到整个基因组范围的结构变化。现在，针对更长片段的分析方法对于基因组结构研究显得越来越重要。另外，由于基因组的复杂性，诸如重复序列和结构变异，限制了基因组的重构和对功能元件的理解。Irys系统克服了这些困难，利用***种新的方法去获取单分子，尤其是长链DNA分子的图像。

长链DNA分子

Irys系统的核心是已经获得专利的芯片技术。这种芯片可以使盘绕的DNA长链随机解开、拉直，进入纳米***通道。这些纳米通道可以防止半卷曲的DNA分子重新缠绕，并且将大量长链DNA分子拉直，平行排列在***起直接拍照成像（图1）。

IrysPrep 试剂盒可以通过限制性内切酶在特异位点进行剪切，然后连接上带有荧光的碱基使长链DNA分子被标记。软件会将长链上的荧光点翻译成相应的序列信息，以帮助组装基因组图谱。成像后，DNA分子会从纳米通道中排出，新***批的DNA分子会进入。这种动态的，多循环的技术使Irys系统可以实现每小时内完成几个GB的DNA分子的线性化和成像。

图1：长链DNA分子在纳米通道中平等排列，生成高质量的图像

关联的基因组

在单分子水平上对全基因组结构的可视化，不但可以减少了由于DNA扩增和打断等引起的偏差，而且也为***个全基因组的物理图谱提供了骨架，使测序结果更有效，更完整。在图谱中，长序列的基因组结构得以保存，这对发现生物学上特异的结构变异是很有裨益的。Irys所测读的超长片段，对于全基因组图谱的构建，连接功能单元，锚定contigs，确定gap的大小，衡量重复单元的大小，分辨拷贝数变化，插入片段以及异位都是非常必要的。

应用

IrysPrep试剂盒和IrysView软件分析系统支持结构变异检测，组装验证，骨架和NGS数据以及客户自定义的***些长片段单分子数据。

结构变异分析

Irys是***款非常适合做结构变异分析的仪器。NGS的短读长不仅在de novo测序数据的拼装上存在困难，也限制了其在CNVs方面的应用。而其他的方法，比如array-CGH，缺少位置信息而且依赖于探针，因此只能应用在已有参考序列的模式物种上。Irys通过长读长，实现了基因组范围内的结构变异检测。长链基因组的自然状态，染色体平衡异位以及插入（重复）具体位置信息都可以被直接观察到。（图2）另外，利用单分子检测，而不是NGS和CGH数据的叠加，可以让群体中的每个个体都能够被直接检测到。

图2：直观的变异位点分析。通过和果蝇的参考序列（绿色）比对，可以准确的发现拷贝数的多态性(串联重复)，该果蝇只有单拷贝（蓝色），并且通过高覆盖度得到了验证。

NGS锚定

Irys在de novo应用中可以拼装出更加完整的数据，和NGS相比，可以在更短时间内提供更完整的基因图谱。任何短读长的测序方法都会造成重复序列很难被正确组装，而Irys特有的超长片段读长，完全可以跨越重复片段和***些包含复杂元件的序列，能够使contig数量和gap数量大大减少（图3）。

其他***些基于限制性内切酶的长片段读取方法会丢失***些小的片段（比如重复序列），但是Irys系统的剪切和加标签的化学方法完全不会破坏DNA长链结构。(图4)

图3：NGS组装。人类MHC区域通过NGS获得5个contigs，通过Irys系统，可以准确地确定它们在基因组中的位置及gaps的大小。（Lam et al, Nature Biotech, 2012）.

图4：长链单分子DNA可通读重复片段。酵母的着丝粒区含有很多重复片段，参考序列中并没有完整地呈现它的拷贝数,Irys系统可以通读长链单分子DNA片段，使这***结果清晰呈现。

组装验证

Irys系统得到的基因组图谱可以与NGS数据拼装出的基因组图谱实现非常完美的交叉验证。在IrysView软件中，可以在图表浏览器中看到与已导入的NGS的组装序列的差异，并且以表格的形式列出，这有助于研究人员进行更深层的单分子成像的研究，同时，Irys还可以帮助科研人员快速地设计新的验证及测序实验。

在IrysPrep试剂的支持下，Irys系统可以作为***个开放的平台为研究人员提供多种形式的遗传分析。基于Irys系统的长链单分子荧光标记方法，更多领域的应用都在不断的研发中。