SABiosciences公司新近推出了第二代功能分类基因芯片。该芯片基于SABiosciences公司开发的200多种 Oligo基因芯片（第***代功能分类基因芯片），结合了实时定量PCR和第***代功能分类基因芯片的优点，可在***次实验中准确定量检测上百个基因的mRNA水平。
SABiosciences公司在第二代功能分类基因芯片的研发过程中，攻克了从反应体系优化到基因准确定量等多方面的技术难点。该芯片不仅克服了实时定量PCR检测基因表达工作量大、耗时久的缺点，而且将基因芯片的检测精度提高到了与实时定量PCR相当的水平。
1、引物设计严谨
SYBR Green可与所有的双链DNA反应（包括引物二聚体），为了使扩增反应集中于目的基因，避免非特异性扩增，引物设计成为关键因素。为得到单***特异的扩增产物，避免扩增出序列相似的非特异性产物，采用BLAST或者其他比对方法，检测引物在相应物种（如人，小鼠或大鼠）全基因组中的特异性。为了保证在相同的PCR条件下（特别是统***的退火温度），不同基因均能扩增出相应的特异性产物，对引物的CG值，解链温度（Tm），以及其他化学和物理的特性都进行了优化调整。为了获得高扩增效率，对扩增片段的长度也进行了优化，***般为100到200bp，确保在统***的循环反应的时间范围内，不同基因均能扩增出完整片段。
2、反应体系优化
为避免非特异性扩增，使用化学修饰的热启动Taq酶，只有经过热激步骤，Taq酶才能发挥扩增活性。同时，反应体系经过优化，可***大限度减少引物二聚体形成，并且保证较难扩增的片段都得到极高的扩增效率。
3、定量结果可靠
在标准的96孔PCR反应仪中进行实时定量PCR实验，为了获得高通量，无法为每个样品单独制备标准曲线。在完全相同的PCR反应条件下，希望表达量不同的多个基因均获得可靠的结果，需要确保每个基因都有较高的扩增效率，从而可采用简单的△△Ct方法计算基因表达量。
SABiosciences第二代功能分类基因芯片
第二代功能分类基因芯片与第***代功能分类基因芯片共同之处在于，对基因按照信号通路或者功能进行有目的的分类和筛选，避免了高通量基因芯片因数据过多而难以分析的缺点，数据分析直接高效。而相较第***代功能分类基因芯片，第二代功能分类基因芯片还具有以下的优越性：使用芯片即可达到实时定量PCR的精度，实验结果无须再进行实时定量PCR验证。
灵敏度高 扩增效率好——总RNA量***低可至0.5ng，扩增效率达到*** |
图1：模板为人总RNA（GA-004）的10倍梯度稀释样品，采用人炎症细胞因子和受体芯片（APH-011A），分别检测看***基因和炎症特异性基因的表达。以Ct值为纵坐标和RNA样品量为横坐标作图。样品量***少为0.5ng，线性范围达到105（0.5ng到5ug）。斜率均值为-3.26±0.41，说明扩增效率达到约*** |
图2：正常乳腺组织和乳腺癌的总RNA（BioChain Institute，Inc.，5.0ug）反转录为cDNA作为模板。采用人癌症信号通路发现者芯片（APH-033A），实验重复三次。不同样品线性范围均可达到105；在不同的样品稀释度下，同***看***基因的相对表达量均相同。 |
图3：为检测芯片重复性，对两种不同样品分别进行3次重复，共6次实验。A显示89个基因（包括84个通路特异性基因和5个看***基因）Ct值的均值，并且每个点上均标明相应的标准差。可见Ct值低时，重复性好（误差范围小），Ct值高，重复性较差（误差范围较大），与实时定量PCR的预期结果***致。B说明，Ct值标准差均值约为0.25个循环。因此，对于大多数基因（Ct值小于30），超过2倍的表达差异（显著性差异）可以准确测出。C通过Ct值的CV值检测重复性。同样，CV值低表明重复性好。 |
特异性高——产物特异性高，可区分同***样品中的同源基因 |
图4：为检测第二代功能基因芯片的特异性，单独测定每个基因的熔解曲线，随后进行凝胶电泳检测。结果表明，熔解曲线和凝胶电泳结果***致，熔解曲线均只出现***个峰，电泳图中只有单***条带，条带大小与预期结果***致。因此，芯片检测结果特异性高，可以区别RNA样品中同***基因***族的同源基因。 |
综上所述，第二代功能分类基因芯片，由于其灵敏度高，样品的使用量低，每张芯片使用的总RNA***少可为0.5ng；可观察到的动态线性范围超过105，可以同时检测表达量差异较大的基因；Ct值的平均差异只有0.25个循环，可检测超过两倍的基因表达量变化。因此，第二代功能分类基因芯片是研究特定信号通路或者***组功能相关基因表达量的理想方法。
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